酵母菌可以用来做什么-关于酵母杂交的那些事（三）

在《酵母杂交物》（一）和（二）中，肖媛基本上介绍了各类酵母杂交物。 当然，还有一些没有介绍。 毕竟种类太多了，萧元只能选择几种。 向您解释这一点的主要目的是扩展您对酵母杂交的理解。 有些方法可能在植物研究领域比较少见，或者基本没用过，但是并不妨碍大家了解。 介绍了这么多内容之后，今天小远终于可以兑现自己的承诺，给大家讲讲酵母杂交在文献中的应用实例了！

01 酵母二杂交实验结果解读

咳咳，在列举文献中的例子之前，小媛想以酵母双杂交为例，给大家讲解一下如何解读酵母双杂交的实验结果！ 之所以专门写这篇文章，是因为我刚接触它的时候，小媛也被它困扰过。 为了让大家不再被千篇一律的内容所困扰，小远决定把自己理解的知识写出来，帮助需要帮助的同学。 让大家少一些烦恼！

图1 使用酵母双杂交实验验证SPX6和PHR2之间的相互作用（Zhong et al., 2018）。

酵母双杂交的结果很多人应该都能看懂，但也不排除看不懂的同学。 为了让不懂的同学能够理解这个结果，小媛决定接下来仔细解释一下。 ！ 因为小媛的目标是不放弃任何一个有疑问的同学！

在告诉你如何看到这个结果之前，让我先告诉你一些背景知识。 这些背景知识是大家理解实验结果所必需的！ 那么让我们来听听吧！ 与大肠杆菌使用的抗生素筛选策略不同，酵母系统经常使用营养标记作为报告基因。 常用的报告基因包括His3、Ura3、Leu2和Ade2（详细信息见表1）。 相应的宿主细菌是具有相应标记的缺陷细胞，必须在含有营养标记的培养基中生长。 Gal4系统中的酵母菌株经过基因改造后不能产生Gal4，也不能合成组氨酸（His）、尿嘧啶（Ura）、亮氨酸（Leu）、腺嘌呤（Ade）等，因此，酵母菌在培养基上无法正常生长缺乏这些营养素。 只有当相应的质粒被转移并且相互作用蛋白存在时，报告基因的表达才能被激活。 因此酵母菌可以用来做什么，通过功能互补，酵母可以在没有营养标记的培养基中生长，从而验证两种蛋白质是否存在。 相互作用。 同样，显色反应也可以用来进一步确认是否存在相互作用。

表1 酵母双杂交实验中使用的报告基因。

我们先看一下图片上方的“+”和“-”。 我们可以看到一共有三列。 右栏：SPX6-AD和PHR2-C-BD对应位置均为“+”号，表示：将这两种质粒共转染至酵母菌株中，作为本实验的实验组； 中栏：BD和SPX6-AD对应的位置为“+”号，表明这两种质粒共转染到作为本实验对照的酵母菌株中。 团体; 左栏：AD和PHR2-C-BD对应的位置是“+”号，表明这两个质粒共转染到酵母菌株中，该酵母菌株也是本实验的对照组。 其中卡通人物，AD为携带Leu基因的质粒pGADT7的缩写，BD为携带Trp基因的质粒pGBKT7的缩写。

SD/-Leu-Trp是指缺少亮氨酸和色氨酸的培养基，即二缺陷平板。 可以看出，三组实验中酵母菌落均生长，即相应的质粒转入酵母菌株中。 具体来说，AD载体携带Leu基因酵母菌可以用来做什么，转入酵母菌株后可以合成亮氨酸。 BD载体携带Trp基因，转入酵母菌株后可合成色氨酸。 如果将两种质粒都转入酵母菌株中，则酵母菌株就能在相应的双缺陷平板上生长。

在二缺陷板证明相应的质粒是否转化到酵母菌株中之后，接下来的四缺陷板就是证明两种蛋白质之间是否存在相互作用。

SD/-Leu-Trp-His-Ade代表缺少亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基，即四缺板。 从图中可以看出，四缺板上只有实验组。 酵母菌株能够生长，但两种对照酵母菌株无法生长。 该结果证明SPX6与PHR2相互作用。 其背后的原理是SPX6和PHR2之间的相互作用将使AD和BD更接近地重组为功能性Gal4转录因子。 Gal4激活下游报告基因His和Ade的表达，酵母菌株可以合成组氨酸和腺嘌呤。 ，加上AD和BD上携带的营养标记基因，相应的酵母菌株就可以在四缺平板上生长。 但由于对照组中没有相互作用，因此无法重组为功能性Gal4转录因子，最终无法在四缺板上生长。

小远闹闹

1、酵母二杂实验中，需要检测BD载体上基因的自激活活性，但发表的文章中一般会省略，放在补充材料中。 每个人都应该意识到这一点！ 具体方法是将需要研究的基因A构建到BD载体中，即pGBKT7-A和AD空载体pGADT7共转化到酵母菌株中，观察其能否在三-上生长。虚证或四虚盘。 如果能够生长，则证明A基因具有自激活活性，不能生长则说明A基因不具有自激活活性。 只有当A基因不具有自激活活性时，才能进行后续的双杂交实验。

2、蓝白类筛选时注意区分X-Gal和X-α-Gal。 它们不是同一件事！ X-Gal是大肠杆菌β-半乳糖苷酶(LacZ)的反应底物，X-α-Gal是酵母α-半乳糖苷酶(MEL1)的反应底物。

X-α-Gal 检测酵母 MEL1 基因的激活。 MEL1是Gal4酵母双杂交系统中的报告基因，编码分泌型α-半乳糖苷酶。 该酶水解无色的 X-α-Gal 底物并最终产生蓝色底物。 表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上呈现蓝色，这是正双杂交效应。 X-α-Gal可以直接检测培养基上酵母二杂交体的相互作用。 使用这种底物可以消除双杂交系统中对 β-半乳糖苷酶溶液和过滤提升测定的需要；

X-Gal用于检测LacZ基因合成的β-半乳糖苷酶的活性。 由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需要将酵母细胞裂解后，才能通过添加β-半乳糖苷酶溶液进行显色和升滤实验，操作过程相对繁琐。

携带MEL1基因的酵母菌株包括：Y2HGold、Y190、AH109、Y187和PG69-2A。

了解了如何阅读实验结果后（这里只介绍酵母二杂交的结果，主要是酵母二杂交非常经典，其他方法基本都是在其基础上发展起来的。关于酵母杂交的东西还有很多，它们都是相辅相成的，所以小媛认为介绍完这个，剩下的大家应该都能做得到。另外，不同的文章、不同的作者对结果的呈现方式也不同，但只要明白了原理，无论形式如何，无论怎么改都不会难倒你！），下面就跟着小媛一起看看具体的文献例子吧！

02 文档应用实例

2.1 酵母一杂种

在“Crocus转录因子CstMYB1和CstMYB1R2通过调节类胡萝卜素基因调节类胡萝卜素代谢”一文中，为了分析CstMYB1和CstMYB1R2的作用机制，作者通过酵母单-检测了它们与类胡萝卜素途径基因PSY和CCD2的相互作用。混合（Y1H）方法。 促进者互动。

首先，作者扩增并克隆了PSY和CCD2的启动子，并进一步扩增了100 bp PSY和170 bp CCD2启动子的天然片段。 这些片段分别包含 1 个和 2 个 MYB 结合区。 此外，作者还相应地生成了它们的突变结构（一个用于 PSY吉祥物设计，两个用于 CCD2）。 分别用天然启动子片段和突变启动子片段制备诱饵菌株，通过检测每个诱饵菌株的最小金黄色素A（AbA）浓度来推断它们与CstMYB1和Cst-MYB1R2的相互作用。 对于PSY启动子来说，只有CstMYB1R2表现出相互作用，当突变型PSY诱饵菌株（pPSY-mut）的PSY启动子片段的MYB结合位点发生突变时，这种相互作用就消失了，如该结果所示。 CstMYB1R2-PSY相互作用的特异性得到证实（图2a）。 同时，作者还观察到，用CCD2天然片段诱饵（pCCD2wt）与CstMYB1和CstMYB1R2共转化的酵母细胞可以在补充有AbA的选择性培养基上生长，这证实了CstMYB1和CstMYB1R2与CCD2启动子的相互作用。 然而，仅一个 MYB 结合位点 (pCCD2mut1) 突变的 CCD2 菌株可以在含有 200 ng mL-1 AbA 的选择性培养基上生长，而两个 MYB 结合位点 (pCCD2mut2) 突变的 CCD2 菌株不能在含有 200 ng mL-1 AbA 的选择性培养基上生长。 200 ng mL-1 AbA。 在选择培养基上生长（图 2b）。 因此，CstMYB1 仅直接与 CCD2 启动子结合，而 CstMYB1R2 与 PSY 和 CCD2 启动子结合。

图2 酵母单杂交实验显示CstMYB1和CstMYB1R2与启动子的结合(a) PSY及其突变形式(b) CCD2及其突变形式。 转化体在添加 200 ng AbA 的 SD-Ura-Leu 上生长（Bhat 等人，2021）。

小元脑

这里的结果格式与上面的例子有所不同，但是其背后的原理基本相同。 它们都将相应的质粒共转化到酵母菌株中。 如果能在相应的培养基上生长，则证明质粒已经转移。 并且有互动。 所以以后遇到不同的结果形式时不要惊慌。 只要掌握了核心原理，任何问题都可以轻松解决！

2.2 核系统酵母二杂交体

虽然我在上面解释结果的时候已经给大家讲过核系酵母二杂种的案例，但是并不妨碍小媛再给大家举一个例子。 在这个例子中，作者做了阳性对照（BD-p53，AD-T）和阴性对照（BD-Lam，AD-T），这两组对照实验可以认为是公认的阳性对照和阴性对照酵母二杂交实验。 它们与研究动物或植物的基因无关！

图 3 使用酵母双杂交分析 EjAP2-1 和 EjMYB1/2 之间的蛋白质相互作用（Zeng 等人，2015）。 将酵母菌株与与 pGBKT7 (BD) 融合的 EjAP2-1 和与 pGADT7 (AD) 融合的 EjMYB1/2 的组合进行共转化。 BD-p53和AD-T用作阳性对照，BD-Lam和AD-T用作阴性对照。 测定不含 Leu、Trp、His 和 Ade、含或不含 AbA 的 SD 培养基上的蛋白质相互作用（SD/-Leu-Trp-His-Ade 和 SD/-Leu-Trp-His-Ade+AbA）。

2.3 膜系统酵母双杂交

在《植物弹状病毒细胞间运动的特异性》一文中，作者利用分裂泛素膜酵母双杂交实验方法验证了两种蛋白之间的相互作用。 由于背景知识有点复杂（可能是因为接触的太少），小袁这里就不给大家介绍那么多了。 他会简单讲一下酵母双杂交部分膜系统的实验结果，让大家明白这类实验的思路应该是什么。 至于结果，得出了什么样的结论？ 如果你有兴趣的话，你可以亲自去看看！

文章中，作者首先对SYNV和TYMaV的亚细胞定位进行了分析，如下图所示：SYNV sc4-GFP和TYMaV P3-GFP主要位于质膜。 此外，细胞核中还存在少量SYNV sc4-GFP。 中间。

图4 SYNV sc4-GFP和TYMaV P3-GFP的亚细胞定位分析（Zhou et al., 2019）。

基于亚细胞定位结果，作者选择采用分裂泛素膜酵母双杂交实验方法来验证SYNV和TYMaV这两种蛋白分别与其他蛋白的N蛋白或P蛋白的相互作用。 具体结果如下：

膜相关的 SYNV sc4 和 TYMaV P3 蛋白分别融合到泛素 (Cub) 和人工转录因子 LexA-VP16 的 C 端，而 SYNV、TYMaV 和 RSMV 的 N 蛋白则融合到 N 端(X-NubG) 或 C 末端，分别。 (NubG-X) 与泛素 (NubG) 的突变 N 末端融合。 通过这个实验，作者发现sc4特异性地与SYNV的N蛋白相互作用，但不与TYMaV和RSMV的N蛋白相互作用（图5A）。 类似地，TYMaV P3仅与TYMaV的同源N蛋白相互作用（图5B）。

同时，SYNV、TYMaV和RSMV的P蛋白分别在N端（X-NubG）或C端（NubG-X）与NubG融合。 MYTH 实验表明，SYNV sc4 与其同源 P 蛋白特异性相互作用，但不与非同源 P 蛋白相互作用（图 5C）。 类似地，也检测到同源的TYMaV P3-P相互作用，尽管TYMaV P3和RSMVP蛋白之间的相互作用较弱（图5D）。

图 5 使用分裂泛素膜酵母双杂交体 (MYTH) 分析杆状病毒 MP-核衣壳核心蛋白相互作用 (Zhou et al., 2019)。 (A 到 D) 诱饵包含融合到 SYNV sc4（A 和 C）或 TYMaV P3（B 和 D）的载体，编码 SYNV 的猎物融合到 N 端（N-NubG）或 C 端（NubG-N） RSMV 或 TYMaV 的 NubG、N（A 和 B）和 P（C 和 D）蛋白。 将酵母细胞与诱饵和猎物质粒共转化。 将转化子在缺乏亮氨酸和色氨酸的缺失培养基(SD-LW)上连续稀释10倍以确认两种质粒的存在。 使用缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤 (SD-LWHA) 的培养基筛选正相互作用。

小元脑

从这个例子我们可以发现，酵母二杂交实验应该安排在亚细胞定位实验之后，并根据亚细胞定位结果选择合适的酵母二杂交方法。 一般来说，只要亚细胞定位不是定位在细胞膜上，就可以选择核系统的酵母二杂交方法进行后续实验，但是对于定位在细胞膜上的蛋白质，则应该选择膜酵母二杂交方法。 -混合方法！

2.4 酵母三杂交（3种蛋白质相互作用）

在《A negative Feedback Loop of TOR Signaling Balances Growth and Stress-Response Trade-offs in Plant》一文中，作者首先利用酵母双杂交和荧光素酶互补实验分别验证了FLZ8-SnRK1α1和FLZ8-RAPTOR1B的相互作用，并随后还利用BiFC实验验证了FLZ8-SnRK1α1和FLZ8-RAPTOR1B在内质网中的相互作用。 根据这些已有的结果，作者做出了猜测，并进行了酵母三杂交实验。

FLZ8 与 SnRK1α1 和 RAPTOR1B 相互作用的细胞质定位相似，表明 FLZ8 可能作为支架蛋白介导 SnRK1α1 和 RAPTOR1B 之间的相互作用。 为了检验这一假设，作者使用了酵母三杂交 (Y3H) 实验，其中 FLZ8 与 SnRK1α1 和 RAPTOR1B 一起在葡萄糖抑制和半乳糖诱导启动子 (GAL1) 的控制下表达。 在半乳糖存在下，FLZ8的表达强烈增强了SnRK1α1与RAPTOR1B的相互作用（图6B），而在葡萄糖存在下生长的细胞中不存在这种相互作用（图6A）。

图6 在添加葡萄糖和半乳糖的条件下，Y3H方法分析了FLZ8存在下SnRK1a1和RAPTOR1B之间的相互作用(Jindal et al., 2022)。

小元脑

这里的酵母三杂需要知道谁充当桥梁。 如果不清楚的话，用这种方法可能很难验证。 就像在这个例子中一样，如果选择了错误的充当桥梁的蛋白质，例如选择了 SnRK1a1。 如果SnRK1a1和RAPTOR1B不相互作用，那么使用这种组合的酵母三重杂交可能得不到我们想要的结果！ 当然，在这个例子中我们也看到，起到桥接作用的蛋白质并不是随机选择的，而是基于一定的实验选择的！ 所以我们要明白，日常实验中很多实验都是环环相扣的！

概括

文章到这里就结束了。 本文中使用的例子经常在植物研究领域的文献中使用。 不过，肖媛关于酵母杂交的方法（1）和（2）还不止这些。 剩下的没有提到的基本上没有找到相关文献。 也许这些方法在动物领域应用较多，但在植物领域应用较少。 如果你看到相关文献，可以和小媛讨论一下！ 另外，在查找文献的过程中还有很多方法是小媛没有提到的。 如果有兴趣，可以自行查找文献。 《关于酵母杂交的那些事》就到这里了。 感谢您的关注！

参考：

Bhat ZY、Mohiuddin T、Kumar A 等人。 番红花转录因子CstMYB1和CstMYB1R2通过调控类胡萝卜素基因调节类胡萝卜素代谢[J]. 植物分子生物学, 2021, 107(1): 49-62.

Jindal S、Sharma M、Awasthi P 等人。 TOR信号的负反馈环平衡植物生长和胁迫反应的权衡[J]. 细胞报告，2022，39(1)：110631。

曾健，李X，徐Q，等。 EjAP2-1是一个AP2/ERF基因，通过与EjMYB转录因子相互作用，是冷害诱导的果实木质化的新型调节因子[J]。 植物生物技术杂志, 2015, 13(9): 1325-1334。

钟Y，王Y，郭J，等。 水稻SPX6通过抑制转录因子PHR2负向调节磷酸盐饥饿反应[J]. 新植物学家, 2018, 219(1): 135-148.

周X，林文，孙K，等。 植物弹状病毒细胞间运动的特异性[J]. 病毒学杂志，2019，93（15）：e00296-19。

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